src/salt/main.tex

   1 \chapter{The effect of ions on unfolding force}
   2 \label{sec:salt}
   3
   4 With the tools in place, it's time to do some science!  As a simple
   5 experiment to demonstrate the utility of the new stack, I ran a series
   6 of velocity clamp unfolding experiments on I27 octomers in PBS
   7 (\cref{sec:sample-preparation}).  After a series of pulls in the
   8 standard buffer, a buffer with additional calcium (from
   9 \CaCl\citep{fisher-CaCl}) was flushed into the fluid cell.  After the
  10 new buffer equilibrated, unfolding experiments were continued.
  11
  12 Previous research on the effect of ions on unfolding forces is small,
  13 although earlier experimental work on amyloid $\beta$ shows decreased
  14 fibrillation with even small
  15 \Ca\ concentrations\citep{chauhan97,itkin11}.  The mechanism behind
  16 this weaker bonding is unclear\citep{chauhan97,zhang06}, although
  17 aspartic and glutamic acid groups tend to have a strong affinity for
  18 cations while arginine has a strong affinity for the
  19 \Cl\ anion\citep{friedman11}.  Of these amino acids, only glutamic
  20 acid occurs in the key hydrogen bond regions responsible for I27
  21 unfolding\citep{lu00b} (\cref{fig:I27:H-bonds}).  \NaCl\ has also been
  22 shown to decrease hydrogen bonding\citep{zidar11}.
  23
  24 \begin{figure}
  25   \begin{center}
  26     \includegraphics[width=0.5\textwidth]{figures/i27/1TIT-hbond}
  27     \caption{The backbone of I27 showing the eight key hydogen bonds
  28       responsible for the critical unfolding force.  Glutamic acids
  29       are highlighted in green.  Based on \xref{lu00b}{figure}{1b}.
  30       For a ribbon diagram of I27 showing the $\beta$-sheets, see
  31       \cref{fig:I27}.  This figure was also generated with
  32       \citetalias{pymol}.\label{fig:I27:H-bonds}}
  33   \end{center}
  34 \end{figure}
  35
  36 We added $0.5\U{M}$ \CaCl\ to our standard PBS
  37 (\cref{sec:sample-preparation}), which is much larger than
  38 extracellular \Ca\ levels on the order of
  39 $2\U{mM}$\citep{isaacs06,itkin11}.  After mixing, both buffers were
  40 adjusted with drops of \HCl\ and \NaOH\ as needed to reach a pH around
  41 7.5 (7.42 for the PBS, and 7.60 for the \Ca-enhanced PBS).
  42
  43 Unfolding experiments carried out on 2013-03-04 using our usual
  44 procedure (\cref{sec:procedure}) yielded an unusual density of clean
  45 unfolding curves\footnote{
  46   Experiments carried out using the same procedures throughout
  47   February were much less successful.
  48 },
  49 with 105 successful pulls concentrated in a two hour window.  Of these
  50 pulls, 37 were in the standard PBS and 68 were in the enhanced
  51 \Ca\ buffer.  Histograms of unfolding forces show decreased
  52 unfolding forces in the \Ca\ buffer (\cref{fig:calcium:histogram}),
  53 which is what we expect due to destabilized hydrogen bonding.
  54
  55 \begin{figure}
  56   \begin{center}
  57     \includegraphics[width=0.9\textwidth]{figures/salt/2013-03-04-CaCl2}
  58     \caption{I27 runs from 2013-03-04 with (red) and without (blue) an
  59       extra $0.5\U{M}$ \Ca.  Clockwise from the upper left, we have
  60       the distance (in nm) between peaks, the unfolding force (in pN),
  61       and example force curve, and a scatter plot of unfolding force
  62       (in pN) versus the distance between peaks.  All of the pulls
  63       were taken with the same Olympus TR400-PSA cantilever with a
  64       pulling speed of $1\U{$\mu$m/s}$.  The green histogram drawn
  65       over the unfolding force histograms is I27 unfolding data in PBS
  66       with $5\U{mM}$ DTT from \citet{carrion-vazquez99b}, rescaled by
  67       a factor of $\frac{1}{2}$ because they had more unfolding
  68       events.\label{fig:calcium:histogram}}
  69   \end{center}
  70 \end{figure}
  71 %
  72 \nomenclature{DTT}{Dithiothreitol
  73   (C\textsubscript{4}H\textsubscript{10}O\textsubscript{2}S\textsubscript{2}),
  74   also known as Cleland's reagent\citep{cleland64}.  It can be used to
  75   reduce disulfide bonding in proteins.}
  76
  77 Modeling I27 as a Bell-model unfolder, we can use \sawsim\ to find the
  78 Bell parameters that best fit these experimental unfolding histograms
  79 (\cref{sec:sawsim:rate:bell,sec:sawsim:results:fitting}).  The results
  80 in \cref{fig:calcium:valley} show that the best fit for standard PBS
  81 was with $\Delta x_u=0.132\U{nm}$ and $k_{u0}=0.222\U{s$^{-1}$}$.  In
  82 the \Ca\ buffer, the best fit was with $\Delta x_u=0.123\U{nm}$ and
  83 $k_{u0}=0.450\U{s$^{-1}$}$.
  84
  85 \begin{figure}
  86   \begin{center}
  87     \subfloat[][]{%
  88       \asyinclude{figures/salt/fit-valley-PBS}
  89       \label{fig:calcium:valley:pbs}}
  90     \subfloat[][]{%
  91       \asyinclude{figures/salt/fit-valley-PBS-0.5M-CaCl2}
  92       \label{fig:calcium:valley:pbs-calcium}}
  93     \caption{\protect\subref{fig:calcium:valley:pbs} Model fit quality
  94       for the standard PBS unfolding histogram data shown in
  95       \cref{fig:calcium:histogram}.
  96       \protect\subref{fig:calcium:valley:pbs-calcium} Model fit
  97       quality for the \Ca-enhanced PBS unfolding histogram data.  The
  98       best fit parameters occur when the Jensen--Shannon divergence is
  99       minimized (at the bottom of these valleys,
 100       \cref{sec:sawsim:results:fitting}).\label{fig:calcium:valley}}
 101   \end{center}
 102 \end{figure}