src/apparatus/sample-preparation.tex

   1 \section{Sample preparation}
   2 \label{sec:sample-preparation}
   3
   4 In mechanical unfolding experiments, one end of the protein is bound
   5 to a substrate and the other binds to the AFM tip.  This allows you to
   6 stretch the protein by increasing the tip-substrate distance using the
   7 piezo.  A common approach is to synthesize proteins with cystine
   8 residues on one end (\cref{eq:I27}) and allow the cystines to bind to
   9 a gold surface\citep{carrion-vazquez99b,carrion-vazquez00,ulman96}.
  10
  11 We prepare gold-surfaces by sputtering gold onto freshly cleaved mica
  12 sheets in a vacuum.  The mica keeps the gold surface protected from
  13 contamination until it is needed.  In order to mount the gold on our
  14 AFM, we glue glass coverslips to the gold using a two part epoxy. %(TODO)
  15 Instead of using mica to protect the gold surface, some labs
  16 evaporate the gold directly onto the coverslips immediately before
  17 running an experiment\citep{carrion-vazquez99b}.
  18
  19 When it is time to deposit proteins on the surface, we peel a
  20 coverslip off the gold-coated mica, exposing the gold surface that had
  21 previously been attached to the mica.  We dispense $5\U{$\mu$L}$ of
  22 I27 solution ($65\U{g/$\mu$L}$) on the freshly-exposed gold, followed
  23 by $5\U{$\mu$L}$ of phosphate buffered saline (PBS).  We allow the
  24 protein to bind to the gold surface for 30 mintues and then load the
  25 coated coverslips into our AFM fluid cell. There are a number of
  26 similar PBS recipes in common
  27 use\citep{florin95,carrion-vazquez00,lo01,brockwell02}, but our PBS is
  28 diluted from 10x PBS stock composed of $1260\U{mM}$ NaCl, $72\U{mM}$
  29 \diNaHPO, and $30\U{mM}$ \NadiHPO\citep{chyan04}.
  30 %
  31 \index{Phosphate buffered saline (PBS)}
  32 \nomenclature[text ]{PBS}{Phosphate buffered saline.}
  33
  34 As an alternative to binding proteins to gold, others have used
  35 EGTA\citep{kellermayer03},
  36 Ni-NTA\citep{schmidt02,itoh04,sakaki05,berkemeier11}, or silanized
  37 glass\citep{sundberg03,ma10}.  Some groups have also functionalized
  38 the cantilever tips by coating them with molecules designed to bind to
  39 the protein\citep{lee05}.  Of these, a Ni-NTA coating is the most
  40 popular\citep{schmitt00}.
  41 %
  42 \nomenclature[text ]{EGTA}{Ethylene glycol tetraacetic acid}