posts/I27-synthesis.mdwn

   1 Over the last few days I've been trying to teach myself enough
   2 genetics to reconstruct [Carrion-Vazquez's poly-I27 synthesis
   3 procedure][cv99].  I'm not quite there yet, but I feel like I've made
   4 enough progress that it's worth posting my notes somewhere public in
   5 case they are useful to others.
   6
   7 Overview
   8 ========
   9
  10 We buy our poly-I27 from [AthenaES][], who market it as [I27O™][I27O].
  11 Perusing their [technical brief][I27O-tb], makes it clear that I2O7™
  12 corresponds to Carrion-Vazquez's I27<sup>RS</sup>₈.  In
  13 [Carrion-Vazquez' original paper][cv99] they describe the synthesis of
  14 both I27<sup>RS</sup>₈ and a variant I27<sup>GLG</sup>₁₂.  Their
  15 I27<sup>RS</sup>₈ procedure is:
  16
  17 * Human cardiac muscle used to generate a [cDNA][] library ([Rief 1997][r97])
  18 * cDNA library amplified with [PCR][]
  19   - 5' primer contained a BamHI restriction site that permitted
  20     in-frame cloning of the monomer into the expression vector pQE30.
  21   - The 3' primer contained a BglII restriction site, two Cys codons
  22     located 3' to the BglII site and in-frame with the I27 domain,
  23     and two in-frame stop codons.
  24 * The PCR product was cloned into pUC19 linearized with BamHI and SmaI.
  25 * The 8-domain synthetic gene was constructed by iterative cloning
  26   of monomer into monomer, dimer into dimer, and tetramer into
  27   tetramer.
  28 * The final construct contained eight direct repeats of the I27
  29   domain, an amino-terminal His tag for purification, and two
  30   carboxyl-terminal Cys codons used for covalent attachment to the
  31   gold-covered coverslips.
  32
  33 They also give the full-length sequence of I27<sup>RS</sup>₈:
  34
  35     Met-Arg-Gly-Ser-(His)₆-Gly-Ser-(I27-Arg-Ser)₇-I27-...-Cys-Cys
  36
  37 They point out the Arg-Ser (RS) amino acid sequence is the BglII/BamHI
  38 hybrid site, [which makes sense](#BglII-BamHI-joint).
  39
  40 Back on the Athena site, they have a [page describing their
  41 procedure][I27O-syn] (they reference the Carrion-Vazquez paper).  They
  42 claim to use the restriction enzyme KpnI in addition to BamHI, BglII,
  43 and SmaI.
  44
  45 Carrion-Vazquez points to the following references:
  46
  47 * [Kempe et al. 1985][k85] (CV16), the source of the multi-step cloning technique.
  48 * [Rief et al.][r97] (CV10), for I27 subcloning.
  49
  50 Rief
  51 ----
  52
  53 In their note 11, Rief et al. explain their synthesis procedure:
  54
  55 * [λ][] cDNA library
  56 * Titin fragments of interest were amplified by PCR
  57 * cloned into pET 9d
  58 * NH₂-terminal domain boundaries were as in [Politou 1996][p96].
  59 * The clones were fused with an NH₂-terminal His₆ tag and a
  60   COOH-terminal Cys₂ tag for immobilization on solid surfaces.
  61
  62 which doesn't help me very much.
  63
  64 Kemp
  65 ----
  66
  67 The [Kempe article][k85] is more informative, focusing entirely on the
  68 synthesis procedure (albiet for a different gene).  Their figure 2
  69 outlines the general approach, and used the following restriction
  70 enzymes: PstI, BamHI, PstI, and BglII.  I'll walk through their
  71 procedure in detail below.
  72
  73 Genetic code
  74 ------------
  75
  76 Wikipedia has a good page on the [genetic code][gcode] for converting
  77 between DNA/mRNA codons and amino acids.  I've written up a little
  78 [[Python]] script, [[mRNAcode.py]], to automate the conversion of
  79 various sequences, which helped me while I was writing this post.  I'm
  80 sure there are tons of similar programs out there, so don't feel
  81 pressured to use mine ;).
  82
  83 Restriction enzymes
  84 -------------------
  85
  86 We'll use the following [restriction enzymes][renz]:
  87
  88 [BamHI][]
  89
  90     5' G|GATC C 3'
  91     3' C CTAG|G 5'
  92
  93 [BglI][] (N is any nucleotide)
  94
  95     5' GCCN NNN|NGGC 3'
  96     3' CGGN|NNN NCCG 5'
  97
  98 [BglII][]
  99
 100     5' A|GATC T 3'
 101     3' T CTAG|A 5'
 102
 103 [HindIII][]
 104
 105     5' A|AGCT T 3'
 106     3' T TCGA|A 5'
 107
 108 [KpnI][]
 109
 110     5' G GTAC|C 3'
 111     3' C|CATG G 5'
 112
 113 [PstI][]
 114
 115     5' C TGCA|G 3'
 116     3' G|ACGT C 5'
 117
 118 [SmaI][]
 119
 120     5' CCC|GGG 3'
 121     3' GGG|CCC 5'
 122
 123 Details
 124 =======
 125
 126 Here's my attempt to reconstruct the details of the polymer-cloning
 127 reactions, where they splice several copies of I27 into the expression
 128 plasmid.
 129
 130 Kempe procedure
 131 ---------------
 132
 133 Inserted their poly-SP into pHK414 (I haven't been able to find any
 134 online sources for pHK414.  Kempe cites [R.J. Watson et al.
 135 *Expression of Herpes simplex virus type 1 and type 2 glyco-protein D
 136 genes using the Escherichia coli lac promoter.* Y. Becker (Ed.),
 137 *Recombinant DNA Research and Viruses.* Nijhoff, The Hague, 1985,
 138 pp. 327-352.][w85])
 139
 140 ### Synthetic SP
 141
 142          HindIII.                                                ,BamHI_.
 143          |      |  Met Arg Pro Lys Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met      |
 144      5’ GA AGC TTC ATG CGT CCG AAG CCG CAG CAG TTC TTC GGT CTC ATG GAT CCG
 145         CT TCG AAG TAC GCA GGC TTC GGC GTC GTC AAG AAG CCA GAG TAC CTA GGC 5’
 146
 147 ### pHK414
 148
 149               _______Linker_sequence______
 150              /                            \
 151                    HindIII    BamHI
 152     ,PstI.   BglII.|    |,SmaI.    |
 153     CTGCAG...AGATCTAAGCTTCCCGGGGATCCAAGATCC
 154     GACGTC...TCTAGATTCGAAGGGCCCCTAGGTTCTAGG
 155     .                                     .
 156     .......................................
 157
 158 ### Synthesizing pSP4-1
 159
 160 #### pHK414 + HindIII + BamHI
 161
 162 They cut a hole in the plasmid…
 163
 164                    HindIII    BamHI.
 165     (PstI)   BglII,|               |
 166     CTGCAG...AGATCTA           GATCCAAGATCC
 167     GACGTC...TCTAGATTCGA           GTTCTAGG
 168     .                                     .
 169     .......................................
 170
 171 #### SP + HindIII + BamHI
 172
 173 … and cut matching snips off their SP gene.
 174
 175     HindIII.                                                ,BamHI_.
 176     |      |  Met Arg Pro Lys Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met      |
 177       AGC TTC ATG CGT CCG AAG CCG CAG CAG TTC TTC GGT CTC ATG
 178            AG TAC GCA GGC TTC GGC GTC GTC AAG AAG CCA GAG TAC CTA G
 179
 180 #### pSP4-1
 181
 182 Mixing the snips together gives the plasmid with a single SP.
 183
 184                    HindIII                                   BamHI.
 185     ,PstI.   BglII.|    | MetArgProLysProGlnGlnPhePheGlyLeuMet    |
 186     CTGCAG...AGATCTAAGCTTCATGCGTCCGAAGCCGCAGCAGTTCTTCGGTCTCATGGATCCAAGATCC
 187     GACGTC...TCTAGATTCGAAGTACGCAGGCTTCGGCGTCGTCAAGAAGCCAGAGTACCTAGGTTCTAGG
 188     .                                                                    .
 189     ......................................................................
 190
 191 Using `-SP-` to abbreviate the HindIII→Met→Met portion (less the
 192 terminal G, which is part of the BamHI match sequence).
 193
 194     ,PstI.   BglII.    BamHI.
 195     CTGCAG...AGATCT-SP-GGATCC
 196     GACGTC...TCTAGA-SP-CCTAGG
 197     .                       .
 198     .........................
 199
 200 ### Synthesizing pSP4-2
 201
 202 The single-SP plasmid, pSP4-1, is split in two parallel reactions.
 203
 204 #### PstI + BamHI
 205
 206         G...AGATCT-SP-G
 207     ACGTC...TCTAGA-SP-CCTAG
 208
 209 #### PstI + BglII
 210
 211     CTGCA     GATCT-SP-GGATCC
 212     G             A-SP-CCTAGG
 213     .                       .
 214     .........................
 215
 216 #### pSP4-2
 217
 218 Then the SP-containing fragments (shown above) are isolated and mixed
 219 together to form pSP4-2.
 220
 221     ,PstI.   BglII.    other.    BamHI.
 222     CTGCAG...AGATCT-SP-GGATCT-SP-GGATCC
 223     GACGTC...TCTAGA-SP-CCTAGA-SP-CCTAGG
 224     .                                 .
 225     ...................................
 226
 227 where the "other" sequence is the result of the BamHI/BglII splice.
 228 Expanding the `-SP-` abbreviation around the SP joint:
 229
 230     ....SP,other_.HindIII.  SP.....
 231     Leu Met Asp Leu Ser Phe Met Arg
 232     CTC ATG GAT CTA AGC TTC ATG CGT
 233     AGA CGT TCG AGC CTA GGA CGT ATG
 234
 235 So the resulting poly-SP will have Asp-Leu-Ser-Phe linking amino
 236 acids.
 237
 238 By repeating the PstI + BamHI / PstI + BglII split-and-join, you can
 239 synthesize plasmids with any number of SP repeats.
 240
 241 I27<sup>RS</sup>₈ procedure
 242 ---------------------------
 243
 244 Like Kempe, Carrion-Vazquez et al. flank the I27 gene with BglII and
 245 BamHI, but they reverse the order.  Here's the output of their PCR:
 246
 247     BamHI-I27-BglII-Cys-Cys-STOP-STOP
 248
 249 From the PDB entry for I27 ([1TIT][]), the amino acid sequence is:
 250
 251     ,leader_.
 252     MHHHHHHSSLIEVEKPLYGVEVFVGETAHFEIELSEPDVHGQWKLKGQPLTASPDCEIIEDGKKHILI
 253     LHNCQLGMTGEVSFQAANAKSAANLKVKEL
 254
 255 To translate this into cDNA, I've scanned thorough the sequence of
 256 [NM_003319.4][], and found a close match from nucleotides 15991
 257 through 16248.
 258
 259     15982 CTAATAAAAG TGGAAAAGCC TCTGTACGGA GTAGAGGTGT TTGTTGGTGA
 260     16032 AACAGCCCAC TTTGAAATTG AACTTTCTGA ACCTGATGTT CACGGCCAGT
 261     16082 GGAAGCTGAA AGGACAGCCT TTGACAGCTT CCCCTGACTG TGAAATCATT
 262     16132 GAGGATGGAA AGAAGCATAT TCTGATCCTT CATAACTGTC AGCTGGGTAT
 263     16182 GACAGGAGAG GTTTCCTTCC AGGCTGCTAA TGCCAAATCT GCAGCCAATC
 264     16232 TGAAAGTGAA AGAATTG
 265
 266 This cDNA match generates an amino acid starting with LIKVEK instead
 267 of the expected LIEVEK, but the LIKVEK version matches amino acids
 268 12677-12765 in [Q8WZ42][] (canonical titin), and there is a natural
 269 variant listed for [12679 K→E][var].
 270
 271 Interestingly, this sequence contains a PstI site at nucleotides 16220
 272 through 16225.  None of our other restriction enzymes have sites in
 273 the I27 sequence.
 274
 275 Carrion-Vazquez et al. list two vectors in their procedure, but I'm
 276 not sure about their respective roles.
 277
 278 ### pQE30
 279
 280 [pQE30][pQE30-a] ([sequence][pQE30-b]) is listed as the "expression
 281 vector", but I'm not sure why they would need a non-expression vector,
 282 as they don't reference cross-vector subcloning after inserting their
 283 I27 monomer into the plasmid.
 284
 285 From the [Qiagen site][pQE30-b], the section around the linker
 286 nucleotides 115 through 203 is:
 287
 288         ,RGS-His epitope__________________. ,BamHI.
 289     Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ala Cys Glu Leu
 290     ATG AGA GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCC GCA TGC GAG CTC
 291     CGT CTC TTC GAT ACG ACA ACG ACA ACG ACA TTC GAA TAC GTA TCT AGA
 292
 293           ,SmaI__.
 294     ,KpnI_.                         HindIII
 295     Gly Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Lys Leu Asn STOP
 296     GGT ACC CCG GGT CGA CCT GCA GCC AAG CTT AAT TAG CTG AG
 297     TTG CAA AAT TTG ATC AAG TAC TAA CCT AGG CCG GCT AGT CT
 298
 299 However, there is no BglII site in this linker.  In fact, there is no
 300 BglII site in the entire pQE30 plasmid, so they'd need to use a third
 301 restiction enzyme to insert their I27 (which does contain a trailing
 302 BglII).
 303
 304 ### pUC19
 305
 306 From [BCCM/LMBP][pUC19-a] and [GenBank][pUC19-b], the section around
 307 the linker nucleotides 233 through 289 is:
 308
 309                                                      ,SmaI_.
 310     HindIII.        ,PstI__.                ,BamHI_.    ,KpnI__.
 311                Met                     STOP
 312     AA GCT TGC ATG CCT GCA GGT CGA CTC TAG AGG ATC CCC GGG TAC CGA
 313
 314     GCT CGA ATT C
 315
 316 However, there is no BglII the entire pUC19 plasmid either, so they'd
 317 need to use a third restiction enzyme to insert their I27.
 318
 319 ### Questions
 320
 321 1. Why do Carrion-Vazquez et al. list two different plasmids?
 322 2. What is the 3'-side restiction enzyme that Carrion-Vazquez et
 323   al. use to insert their I27 into their plasmid?
 324 3. What is the remote restriction enzyme that Carrion-Vazquez et
 325   al. use to break their opened plasmids (Kempe PstI equivalent).
 326 4. The BamHI and SmaI sites in pUC19 overlap, so it is unclear how you
 327   could use both to "linearize" pUC19.  It would seem that either one
 328   would open the plasmid on its own, although I'm not sure you could
 329   "heal" the blunt-ended SmaI cut.
 330 5. Since the Arg-Ser joint is formed by a BglII/BamHI overlap, why are
 331   there no BglII-coded amino acids after the last I27 in the I27<sup>RS</sup>₈
 332   sequence?  If there is, why do Carrion-Vazquez et al. not
 333   acknowledge it when they write [3]:
 334
 335   > The full-length construct, I27<sup>RS</sup>₈, results in the
 336   > following amino acid additions: (i) the amino-terminal sequence is
 337   > Met-Arg-Gly-Ser-(His)6-Gly-Ser-I27 codons; (ii) the junction
 338   > between the domains (BamHI-BglII hybrid site) is Arg-Ser; and
 339   > (iii) the protein terminates in Cys-Cys.
 340
 341   Since they don't acknowledge an I27-Arg-Ser-Cys-Cys ending, might
 342   there be more amino acids in the C terminal addition?
 343
 344 ### Working backward
 345
 346 Since I'm stuck trying to get I27 into either plasmid, let's try and
 347 work backward from
 348
 349     Met-Arg-Gly-Ser-(His)₆-Gly-Ser-(I27-Arg-Ser)₇-I27-...-Cys-Cys
 350
 351 #### <a id="BglII-BamHI-joint">BglII/BamHI joint</a>
 352
 353 The BglII/BamHI overlap would produce the expected Arg-Ser joint.
 354
 355     BglII   BamHI
 356     A     + GATCC = AGATCC = Arg-Ser
 357     TCTAG       G   TCTAGG
 358
 359 #### Final plasmid (pI27-8)
 360
 361 The beginning of this sequence looks like the start of pQE30's linker,
 362 so we'll assume the final plasmid was:
 363
 364     remote ...    ,RGS-His epitope__________________. ,BamHI. I27...
 365            ... Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Leu Ile ...
 366     ???    ... ATG AGA GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCC CTA ATA ...
 367     ???    ... CGT CTC TTC GAT ACG ACA ACG ACA ACG ACA TTC GAA GAT TAT ...
 368
 369     ........I27 joint_. I27 ... final I27 ,BglII.                 continuation of pQE30?
 370     ... Glu Leu         Leu ...       Leu Arg Ser Cys Cys STOPSTOP...
 371     ... GAA TTG AGA TCC CTA ...       TTG AGA TCT TGC TGC TAG TAG ...
 372     ... CTT AAC TCT AGG GAT ...       GAT CTC GAG GTA GTA GCT GCT ...
 373
 374 #### Penultimate plasmid (pI27-4)
 375
 376     remote ...    ,RGS-His epitope__________________. ,BamHI. I27...
 377                Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Leu Ile ...
 378     ???    ... ATG AGA GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCC CTA ATA ...
 379     ???    ... CGT CTC TTC GAT ACG ACA ACG ACA ACG ACA TTC GAA GAT TAT ...
 380
 381         ... I27 joint_. I27 ... fourth I27 ,BglII.                 continuation of pQE30?
 382     ... Glu Leu         Leu ...        Leu Arg Ser Cys Cys STOPSTOP...
 383     ... GAA TTG AGA TCC CTA ...        TTG AGA TCT TGC TGC TAG TAG ...
 384     ... CTT AAC TCT AGG GAT ...        GAT CTC GAG GTA GTA GCT GCT ...
 385
 386 ##### pI27-4 + BamHI + remote
 387
 388     remote                                             ,BamHI. I27...
 389                                                                Leu Ile ...
 390     ?                                                   GA TCC CTA ATA ...
 391     ??                                                       A GAT TAT ...
 392
 393     ....... I27 joint_. I27 ... fourth I27 ,BglII.                 continuation of pQE30?
 394     ... Glu Leu         Leu ...        Leu Arg Ser Cys Cys STOPSTOP...
 395     ... GAA TTG AGA TCC CTA ...        TTG AGA TCT TGC TGC TAG TAG ...
 396     ... CTT AAC TCT AGG GAT ...        GAT CTC GAG GTA GTA GCT GCT ...
 397
 398 ##### pI27-4 + BglII + remote
 399
 400     remote ...    ,RGS-His epitope__________________. ,BamHI. I27...
 401                Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Leu Ile ...
 402      ??    ... ATG AGA GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCC CTA ATA ...
 403       ?    ... CGT CTC TTC GAT ACG ACA ACG ACA ACG ACA TTC GAA GAT TAT ...
 404
 405     ....... I27 joint_. I27 ... fourth I27 ,BglII.
 406     ... Glu Leu         Leu ...        Leu
 407     ... GAA TTG AGA TCC CTA ...        TTG A
 408     ... CTT AAC TCT AGG GAT ...        GAT CTC GA
 409
 410 ##### pI27-8
 411
 412     remote ...    ,RGS-His epitope__________________. ,BamHI. I27...
 413                Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Leu Ile ...
 414     ???    ... ATG AGA GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCC CTA ATA ...
 415     ???    ... CGT CTC TTC GAT ACG ACA ACG ACA ACG ACA TTC GAA GAT TAT ...
 416
 417     ....... I27 joint_. I27 ... fourth I27 ,other. I27...
 418     ... Glu Leu         Leu ...        Leu Gly Ser Leu Ile ...
 419     ... GAA TTG AGA TCC CTA ...        TTG AGA TCC CTA ATA ...
 420     ... CTT AAC TCT AGG GAT ...        GAT CTC GAA GAT TAT ...
 421
 422     ....... I27 joint_. I27 ... fourth I27 ,BglII.                 continuation of pQE30?
 423     ... Glu Leu         Leu ...        Leu Arg Ser Cys Cys STOPSTOP...
 424     ... GAA TTG AGA TCC CTA ...        TTG AGA TCT TGC TGC TAG TAG ...
 425     ... CTT AAC TCT AGG GAT ...        GAT CTC GAG GTA GTA GCT GCT ...
 426
 427 #### Continuing to the first plasmid, pI27-1 must have been
 428
 429     remote ...    ,RGS-His epitope__________________. ,BamHI. I27...
 430            ... Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Leu Ile ...
 431     ???    ... ATG AGA GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCC CTA ATA ...
 432     ???    ... CGT CTC TTC GAT ACG ACA ACG ACA ACG ACA TTC GAA GAT TAT ...
 433
 434     ........I27 ,BglII.                 continuation of pQE30?
 435     ... Glu Leu Arg Ser Cys Cys STOPSTOP...
 436     ... GAA TTG AGA TCT TGC TGC TAG TAG ...
 437     ... CTT AAC CTC GAG GTA GTA GCT GCT ...
 438
 439 ### Potential pQE30 insertion points
 440
 441 * Kpn1 (present after BamHI in both plasmids)
 442
 443 ### Potential remote restriction enzymes
 444
 445 * BglI (pQE30 nucleotides 2583-2593 (GCCGGAAGGGC), Amp-resistance
 446   3256-2396; pUC19 has two BglI sites (bad idea))
 447
 448
 449 [cv99]: http://dx.doi.org/10.1073/pnas.96.7.3694
 450 [r97]: http://dx.doi.org/10.1126/science.276.5315.1109
 451 [PCR]: http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction
 452 [cDNA]: http://en.wikipedia.org/wiki/Complementary_DNA
 453 [λ]: http://en.wikipedia.org/wiki/Lambda_phage
 454 [AthenaES]: http://www.athenaes.com/
 455 [I27O]: http://www.athenaes.com/I27OAFMReferenceProtein.php
 456 [I27O-tb]: http://www.athenaes.com/tech_brief_I27O_protein.php
 457 [I27O-syn]: http://www.athenaes.com/Projects_Polyproteins.php
 458 [k85]: http://dx.doi.org/10.1016/0378-1119(85)90318-X
 459 [p96]: http://dx.doi.org/10.1006/jmbi.1996.0050
 460 [gcode]: http://en.wikipedia.org/wiki/Genetic_code
 461 [renz]: http://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_enzyme
 462 [BamHI]: http://en.wikipedia.org/wiki/BamHI
 463 [BglI]: http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_restriction_enzyme_cutting_sites:_Bd-Bp#Bd_-_Bp
 464 [BglII]: http://en.wikipedia.org/wiki/BglII
 465 [HindIII]: http://en.wikipedia.org/wiki/HindIII
 466 [KpnI]: http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_restriction_enzyme_cutting_sites:_G-K#K
 467 [PstI]: http://en.wikipedia.org/wiki/PstI
 468 [SmaI]: http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_restriction_enzyme_cutting_sites:_S#S
 469 [w85]: http://books.google.com/books?id=eA6iSmR0I4wC
 470 [1TIT]: http://www.pdb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1TIT
 471 [NM_003319.4]: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_003319
 472 [Q8WZ42]: http://www.uniprot.org/blast/?about=Q8WZ42[12677-12765]
 473 [var]: http://web.expasy.org/cgi-bin/variant_pages/get-sprot-variant.pl?VAR_040140
 474 [pQE30-a]: http://www.qiagen.com/literature/vectors_pqe.aspx
 475 [pQE30-b]: http://www.qiagen.com/literature/pqesequences/pqe-30w.txt
 476 [pUC19-a]: http://bccm.belspo.be/db/lmbp_plasmid_details.php?NM=pUC19
 477 [pUC19-b]: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/M77789?report=genbank
 478
 479 [[!tag tags/theory]]