src/apparatus/polymer-synthesis.tex

   1 \section{Protein polymer synthesis---Titin I27}
   2 \label{sec:polymer-synthesis}
   3
   4 Early experiments in force spectroscopy involved
   5 DNA\citep{bustamante94,florin95}, but before long they were also
   6 investigating proteins.  Native titin was one of the first proteins
   7 studied with force spectroscopy\index{titin}\citep{rief97a}.  Titin is
   8 a muscle protein involved in passive elasticity
   9 (\cref{fig:skeletal-muscle}), so it is an ideal subject when examining
  10 the effect of mechanical force\citep{labeit95}.  Titin is also
  11 interesting because, while it is one of the largest known proteins, it
  12 is composed of a series of globular domains.  When \citet{rief97a}
  13 carried out their seminal unfolding experiment, they observed a very
  14 characteristic sawtooth as the domains unfolded (see
  15 \cref{sec:procedure} for a discussion of these sawteeth).
  16
  17 \begin{figure}
  18   \includegraphics[width=0.7\textwidth]{figures/binary/skeletal_muscle}%
  19   \caption{Biological role of titin\index{titin}.  Moving clockwise
  20     from the upper left you can see a bone/muscle group, a muscle
  21     fiber, a myofibril, and a sarcomere.  In the sarcomere, the white,
  22     knobbly filaments are actin.  The myosin bundles are blue, and the
  23     titin linkers are red.  When the muscle contracts, the myosin
  24     heads walk up the actin filiaments, shortening the sarcomere.
  25     When the muscle relaxes, the myosin heads release the actin
  26     filimants and slide back, lengthening the sarcomere.  Titin
  27     functions as an entropic spring that keeps the myosin from falling
  28     out of place during the passive, relaxed stage.  This figure is
  29     adapted from \citet{skeletal_muscle}.\label{fig:skeletal-muscle}}
  30 \end{figure}
  31
  32 Unfortunately, it is difficult to analyze the unfolding of native
  33 titin, because the heterogenous globular domains make it hard to
  34 attribute a particular subdomain to a partuclar unfolding event.
  35 Unfolding a single domain is not feasable because the large radius of
  36 curvature of an AFM tip ($\sim20\U{nm}$\citep{olympus-tr400psa})
  37 dwarfs the radius of a globular domain
  38 ($\sim2\U{nm}$\citep{improta96}).  When such a large tip is so close
  39 to the substrate, van der Waals forces and non-specific binding with
  40 the surface dominate the tip-surface interaction.  In order to
  41 increase the tip-surface distance while preserving single molecule
  42 analysis, \citet{carrion-vazquez99b} synthesized a protein composed of
  43 eight repeats of immunoglobulin-like domain 27 (I27\index{I27}), one
  44 of the globular domains from native titin (\cref{fig:I27}).  Octameric
  45 I27 produced using their procedure is now available
  46 commercially\citep{athenaes-i27o}.
  47 %
  48 \nomenclature[text ]{I27}{Immunoglobulin-like domain 27 from human
  49   titin.}
  50
  51 \begin{figure}
  52   \includegraphics[width=2in]{figures/i27/1TIT}
  53   \caption{I27, the immunoglobulin-like domain 27 from human titin
  54     (\href{http://dx.doi.org/10.2210/pdb1tit/pdb}{PDB ID: 1TIT})%
  55     \citep{improta96}.  The entire domain is $4.7\U{nm}$ from end to
  56     end.  Figure generated with \citetalias{pymol}.
  57     \label{fig:I27}\index{I27}}
  58 \end{figure}
  59
  60 Synthetic proteins are generally produced by creating a plasmid coding
  61 for the target protein, inserting the plasmid in a bacteria, waiting
  62 while the bacteria produce your protein, and then purifying your
  63 proteins from the resulting culture.  In this case,
  64 \citet{carrion-vazquez99b} extracted messenger RNA coding for titin
  65 from human cardiac tissue\citep{rief97a}, and used reverse
  66 transcriptase to generate a complementary DNA (cDNA) library from
  67 human cardiac muscle messenger RNA.  This cDNA is then amplified using
  68 the polymerase chain reaction (PCR), with special primers that allow
  69 you to splice the resulting cDNA into a plasmid (which ends up with
  70 one I27).  Then they ran another PCR on the plasmid, linearized the
  71 plasmid with two restriction enzymes, and grafted two I27-containing
  72 sections together to form a new plasmid (now with two I27s,
  73 \cref{fig:plasmid}).  Another PCR-split-join cycle produced a plasmid
  74 with four I27s, and a final cycle produced a plasmid with eight.  The
  75 eventual plasmid vector has the eight I27s and a host-specific
  76 promoter that causes the bacteria to produce large quantities of I27.
  77 The exact structure of the generated octamer
  78 is\citep{carrion-vazquez99b}
  79 \nomenclature[text ]{cDNA}{Complementary DNA.}
  80 \nomenclature[text ]{PCR}{Polymerase chain reaction.}
  81
  82 \begin{center}
  83   Met-Arg-Gly-Ser-(His)$_6$-Gly-Ser-(I27-Arg-Ser)$_7$-I27-\ldots-Cys-Cys
  84   \label{eq:I27}
  85 \end{center}
  86
  87 \begin{figure}
  88   \includegraphics[width=0.9\textwidth]{figures/binary/kempe85-fig2}%
  89   \caption{Example of gene duplication via plasmid splicing
  90     (\xref{kempe85}{figure}{2}).  \citet{kempe85} use a different
  91     gene, but some of the restriction enzymes are shared with
  92     \citet{carrion-vazquez99b}.  The overall approach is
  93     identical.\label{fig:plasmid}}
  94 \end{figure}
  95
  96 \index{\species{Escherichia coli}}
  97 The plasmid is then transformed into the host, usually
  98 \species{Escherichia coli}\citep{carrion-vazquez99b,bartels03,ma10} or
  99 a proprietary equivalent such as Agilent's SURE 2 Supercompetent
 100 Cells\citep{agilent-sure2,carrion-vazquez00}.  The infected cells are
 101 cultured to express the protein.
 102 %
 103 \nomenclature[text ]{Bacterial transformation}{The process by which
 104   bacterial cells take up exogenous DNA molecules.}
 105 \nomenclature[text ]{Exogenous DNA}{DNA that is outside of a cell.}
 106
 107 The octamer is then purified from the culture using immobilized metal
 108 ion affinity chromatography (IMAC), where the His-tagged end of the
 109 octamer covalently bonds to a metal ion that is bound to the column
 110 media (e.g. Ni-NTA\index{Ni-NTA} coated
 111 beads)\citep{carrion-vazquez00,bartels03,ma10}.  Once the rest of the
 112 broth has been washed out of the chromatography column, the octamer is
 113 eluted via either another molecule which competes for the metal
 114 ions\citep{ma10} or by changing the pH so the octamer is less
 115 attracted to the metal ion.
 116 %
 117 \nomenclature[text ]{IMAC}{Immobilized metal ion affinity
 118   chromatography.}
 119 \nomenclature[text ]{Ni-NTA}{Nickle nitrilotriacetic acid.}
 120
 121 \nomenclature[text ]{Ala}{Alanine, an amino acid.}
 122 \nomenclature[text ]{Arg}{Arginine, an amino acid.}
 123 \nomenclature[text ]{Asn}{Asparagine, an amino acid.}
 124 \nomenclature[text ]{Asp}{Aspartic acid, an amino acid.}
 125 \nomenclature[text ]{Cys}{Cystine, an amino acid.}
 126 \nomenclature[text ]{Glu}{Glutamic acid, an amino acid.}
 127 \nomenclature[text ]{Gln}{Glutamine, an amino acid.}
 128 \nomenclature[text ]{Gly}{Glycine, an amino acid.}
 129 \nomenclature[text ]{His}{Histidine, an amino acid.}
 130 \nomenclature[text ]{Ile}{Isoleucine, an amino acid.}
 131 \nomenclature[text ]{Leu}{Leucine, an amino acid.}
 132 \nomenclature[text ]{Lys}{Lysine, an amino acid.}
 133 \nomenclature[text ]{Met}{Methionine, an amino acid.}
 134 \nomenclature[text ]{Phe}{Phenylalanine, an amino acid.}
 135 \nomenclature[text ]{Pro}{Proline, an amino acid.}
 136 \nomenclature[text ]{Ser}{Serine, an amino acid.}
 137 \nomenclature[text ]{Thr}{Threonine, an amino acid.}
 138 \nomenclature[text ]{Trp}{Tryptophan, an amino acid.}
 139 \nomenclature[text ]{Tyr}{Tyrosine, an amino acid.}
 140 \nomenclature[text ]{Val}{Valine, an amino acid.}